《水通道蛋白基因功能研究——AQP1在肿瘤血管生成中的作用及EYFP-V163S体内水转运研究转基因鼠模型的建立》由会员分享，可在线阅读，更多相关《水通道蛋白基因功能研究——AQP1在肿瘤血管生成中的作用及EYFP-V163S体内水转运研究转基因鼠模型的建立（77页珍藏版）》请在维思文库上搜索。

1、东北师范大学 博士学位论文 水通道蛋白基因功能研究AQP1在肿瘤血管生成中的作用及 EYFP-V163S体内水转运研究转基因鼠模型的建立 姓名：冯学超 申请学位级别：博士 专业：细胞生物学 指导教师：麻彤辉 20050501 摘要 水通道蛋I ! l ( A q u a p o r i n s ，A Q P s ) 是广泛存在于原核和真核细胞膜上转运水的特异 蛋白孔道。自从九十年代初发现红细胞膜上的水通道蛋白( A Q P l ) 以来，有关水通 道蛋白结构与功能的研究取得了迅速的、系列性的进展。到目前为止已克隆的哺乳 动物水通道蛋白家族有1 3 个成员，其基因结构、基因表达调控、染色体定位、

2、蛋白 结构、组织分布和生理功能得到了较为深入的研究。对人类A Q P 基因突变和应用 A Q P 基因敲除鼠进行的大量研究表明水通道蛋白在体内液体转运生理中起重要作 用。关于A Q P 基因功能的研究正在不断深入，并与体内液体转运生理以外更为广泛 的生理和病理过程联系起来。本研究对A Q P l 在肿瘤血管生成中的作用以及应用动 物转基因技术建立敏感的体内细胞膜水通透性测定模型进行了研究和探索。 A Q P l 是唯一表达在内皮细胞上的水通道蛋白，负责内皮细胞跨膜和跨细胞高 效水转运。A Q P l 除了各种正常组织的微小血管的内皮细胞上高度表达，还在多种肿 瘤的微小血管中表达，提示A Q P

3、 l 可能参与肿瘤血管的生成。本研究应用A Q P l 敲 除小鼠研究了A Q P l 在肿瘤血管生成和肿瘤发生中的作用。以C 5 7 B L 6 J 背景的A Q P l 敲除鼠为研究对象，将高恶性黑色素瘤细胞B 1 6 F 1 0 ( 来源于C 5 7 ) 按2 1 0 5 只的接 种量背部皮下接种，1 2 天后取瘤称重，固定并进行病理分析，结果显示A Q P l 敲除 小鼠肿瘤比A Q P l 野生型小鼠的肿瘤小近3 0 ；A Q P l 在野生型小鼠黑色素瘤血管 内皮细胞上高表达，而在A Q P l 敲除小鼠肿瘤血管内皮细胞呈阴性表达。在病理结 构上，黑色素瘤细胞围绕血管分支呈岛状分布

4、。野生型小鼠黑色素瘤内血管分布密 度较高，管腔较细小；而A Q P l 敲除小鼠黑色素瘤内血管密度较低，管腔粗大，围 绕血管的肿瘤细胞岛周边坏死区域明显大于野生小鼠肿瘤。基于C D 3 1 染色的血管 密度统计结果表明：A Q P l 敲除小鼠肿瘤血管的平均密度为4 7 个m m 2 ，而野生型 小鼠的平均密度则为1 4 2 个m m 2 ，两者相差极为显著。可见，A Q P l 在肿瘤血管生 成中发挥重要作用，其机制值得进一步研究。 本论文另一部分工作是建立表达对氯离子敏感的绿色荧光蛋白突变体 E Y F P V 1 6 3 S 的转基因小鼠模型。目的是用于水和氯离子跨膜转运的体内研究。到目

5、 前为止，由于缺乏体内研究手段，人们对水和氯离子跨膜和跨细胞转运的研究主要是 通过对体外培养的细胞研究来实现的；对水通道和氯离子通道的理论知识也主要是基 于对体外细胞研究，缺乏在体组织细胞膜水分子和氯离子通透性的直接研究。为了更 深入地研究水和氯离子跨膜和跨细胞运输情况，完善水通道和氯离子通道的理论知 识，同时实现体内各组织细胞对水和氯离子跨膜和跨细胞运输情况的系统研究，急需 发展体内研究手段。随着生命科学从基因研究到功能研究的转变，发展体内研究手段 更显重要。所以，建立对氯离子浓度极为敏感的E Y F P - v 1 6 3 S 的转基因小鼠模型，实 现对水和氯离子跨膜转运的体内研究具有重要

6、的意义。建立全身性高表达 T E Y F P V 1 6 3 S 的转基因小鼠模型，利用该动物模型，通过器官组织体内原位灌注和动 态荧光记录，可以实现对各种组织细胞膜的水和氯离子通透性直接测定。同时也可将 各种表达E Y F P V 1 6 3 S 的组织细胞进行体外培养建系，将之作为水通道或氯离子通道 调节剂筛选和功能测定模型。 本研究以氯离子敏感且特异性很强的E Y F P V 1 6 3 S 作为目的基因，采用基因敲入 技术，将E Y F P V 1 6 3 S 基因定点整合到小鼠E 1 4 胚胎干细胞基因组的管家基因 R O S A 2 6 位点中，借助该基因的强启动子表达E Y F

7、P - V 1 6 3 S 。利用双筛选策略构建打 靶载体，大大地提高了打靶效率，使其阳性率达到6 0 。建立稳定表达E Y F P V 1 6 3 S 的E 1 4 胚胎干细胞株并通过显微注射，将其导入到囊胚腔，目前己获得两只嵌合体鼠， 但是转基因传代未能成功。P C R 检测结果显示，E Y F P V 1 6 3 S 主要分布在大脑、骨骼 肌、心脏、。肾脏及肺血管中，睾丸则为阴性，进一步的免疫组化也证实E Y F P - V 1 6 3 S 主要在上述的五种器官或组织中表达，在大脑中表达最强，肾小管中表达最弱，睾丸 为阴性。这说明E s 细胞未能进入嵌合体鼠的生殖系统，本研究正在用不同的

8、 E Y F P V 1 6 3 S 干细胞克隆进行囊胚注射，以期最终获得生殖细胞转染的E Y F P - V 1 6 3 S 转基因鼠。 关键词：水通道A Q P l ：基因打靶；血管生成；肿瘤生长；对氯离子敏感荧光蛋白突 变体；转基因小鼠：氯离子通道 I I A b s t r a c t A q u a p o r i n s ( A Q P s ) w e r ef o u n da saf a m i l yo f i n t r i n s i cm e m b r a n ep r o t e i ni nt h e e a r l yo f19 9 0 St h a tf u

9、n c t i o na ss p e c i a lw a t e r - t r a n s p o r t i n gc h a n n e l sa tt h em e m b r a n eo f e u k a r y o c y t ea n dp r o k a r y o c y t e S i n c eA Q P lw a sf i r s t c l o n e df r o mt h em e m b r a n eo f e r y t h r o c y t e ，r a p i da n d s e r i a lp r o g r e s sh a sb e

10、e nm a d ei nA Q P s s t r u c t u r ea n df i m c t i o n T i l l n o w , t h i r t e e nm e m b e r s o fA Q P sh a v eb e e nd e f i n e df r o mm a n m a a l sa n dt h es t u d i e so nt h e i r g e n es t r u c t u r e ，e x p r e s s i o nr e g u l a t i o n ，c h r o m o s o m e l o c a t i o n

11、 , t i s s u ed i s t r i b u t i o n ，a n d p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o nh a v eb e e nf u r t h e r e d I t h a sb e e nc o n f i r m e dt h a tA Q P sp l a ya l l i m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lp a r ti nb o d y f l u i dt r a n s p o r t I no u rs t u d y , t h er o l eo f

12、A Q P li nt t a n o r a n g i o g e n e s i sh a sb e e ns t u d i e da n dt h ee s t a b l i s h m e n to f E Y F P - V 1 6 3 Sa a n s g e n i cm i c ef o rw a t e r 恤a n s p o a s t u d i e si n v i v o e x p l o r e d A Q P l ，w h i c hi st h eo n l yi n t r i n s i cm e m b r a n ep r o t e i ne

13、 x p r e s s e da te n d o t h e l i u mo f n o r m a lt i s s u e sf u n c t i o n i n ga Sw a t e r - t r a n s p o r t e r ，h a sb e e nr e p o r t e dt oe x p r e s sh i g h l yi n m i c r o v e s s e l so f m a n y d i f f e r e n tt y p et u m o r si n d i c a t i n gt h ep o s s i b l ei n v

14、o l v e m e n to f A Q P l i nt u m o ra n g i o g e n e s i s I nO u rs t u d y ，A Q P l - k n o c k o u tm i c ea n dw i l d - t y p e ，w h oi so nt h e g e n e t i cb a c k g r o u n do fC 5 7 B L 6 Jw e r ei n j e c t e ds u b c u t a n e o u s l yw i t ha b o u t2 x l0 3 c e l lo f B 1 6 F 1 0m

15、 e l a n o m ar e s p e c t i v e l yA f t e r1 2d a y s ，t u m o r sw e r eh a r v e s t e da n dw e i g h e d ，t h e r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tn e a r l y3 0 r e t a r d e dg r o w t ho fi n o c u l a t e dm e l a n o m ai nA Q P l k n o c k o u tm i c e c o m p a r e d t ot u m o

16、 r si n w i l d - t y p em i c e I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y o f m e l a n o m as e c t i o n sr e v e a l e ds t r o n gA Q P lp r o t e i nl a b e l i n gi ne n d o t h e l i u mo ft u m o rb l o o d v e s s e l si nw i l d - t y p em i c ea n dn e g a t i v el a b e l i n go fA Q P li

17、 nt h ec o u n t e r p a r ts t r u c t u r e si n A Q P l - k n o c k o u tm i c e O nt h es a m et u m o rs e c t i o n ss t a i n e db yh e m a t o x y l i n ，m e l a n o m a c e l l sf o r m e di s l a n d sa r o u n dm i c r o v e s s e l si nt h ec e n t e r B a s e do nC D 3 1p r o t e i nl a

18、 b e l i n g ，i t W a s e a s i l ys e e nt h a th i 曲- d e n s i t ya n dt h i nm i c r o v e s s e l s ( 1 4 2 m m 2 ) l o c a t e di nt h ec e n t e ro f t u m o ri s l a n d si nw i l d t y p em i c e ，w h e r e a s s p a r s e a n de n l a r g e d v e s s e l s ( 4 7 m m 2 ) w e r e e v i d e n

19、 ti nt u m o ri s l a n d si nA Q P lk n o c k o u tm i c ec o i n c i d e n tw i t hl a r g e rn e c r o t i ca r e ai n o u t e rl a y e ro ft h ei s l a n d s T h e s er e s u l t sp r o v i d ed e f i n i t i v ee v i d e n c et h a tl a c k i n go fw a t e r c h a n n e lA Q P lr e s u l t si n

20、d e f e c t i v et u m o r a n g i o g e n e s i sa n d r e t a r d e dt u m o r g r o w t h t h a tm a y b ei n v o l v e di ni n s u f f i c i e n tb l o o ds u p p l ya n d o ra b n o r m a lt r a n s e n d o t h e l i a lf l u i dt r a n s p o r t T h e u n d e r l y i n gm o l e c u l a r a n d

21、c e l l u l a rm e c h a n i s m sa r ew o r t hf u r t h e ri n v e s t i g a t i o n A n o t h e rt a s kf o ro u rs t u d yi st oe s t a b l i s ht h et r a n s g e n i cm i c em o d e le x p r e s s i n g h a l i d e - s e n s i t i v eE Y F P - V 1 6 3 S t h ea i mi st o s t u d y i nv i v ot r

22、 a n s p o r t i n go fw a t e ra n dC 1 。 U n t i ln o w , f o rt h el a c ko fi n v e s t i g a t i o nm e a n si nv i v o t h er e s e a r c h e so fw a t e ra n dC l 一 1 1 1 t r a n s - m e m b r a n et r a n s p o r t i n ga r eo n l yc a r r i e do u to nc u l t u r e dc e l l s ，t h ek n o w

23、l e d g ea b o u t w a t e ra n dC 1 一c h a n n e li sa l s ob a s e do n s t u d yo f c u l t u r e dc e l l s T h e d i r e c t l y r e s e a r c hm e a n si ss t a r v e df o r f o r f u r t h e r i n gi n v e s t i g a t i o n o n t r a n s m e m b r a n et r a n s p o r t i n go fw a t e ra n d

24、C 1 一a n dp e r f e c t i n gt h et h e o r ya b o u tt h e f u n c t i o no fw a t e ra n dC I c h a n n e l s D e v e l o p i n gr e s e a r c hm e a n si nv i v oa p p e a r sm o r e i m p o r t a n ta n di n d i s p e n s a b l y , e s p e c i a l l yw i t ht h et r a n s i t i o nf r o mg e n e

25、 - e r at of i m c t i o n e r a T h eS u c c e s so fe s t a b l i s h i n gE Y F P V 1 6 3 S t r a n s g e n i c m i c em o d e lw i l l b r i n g i ti n t o r e a l i z a t i o nt Om e a s u r ed i r e c t l yw a t e ra n dC 1 一t r a n s m e m b r a n et r a n s p o r t i n gi nd i f f e r e n t

26、t i s s u e sb yp e r f u s i n gw i t hh a l i d e sa n dd e t e c t i n gd y n a m i c a l l yt h ec h a n g eo ff l u o r e s c e n t A tt h e s a m et i m e ，c e l l sf r o mt i s s u e so fE Y F P - V 16 3 St r a n s g e n i cm i c ec o u l db ec u l t u r e da sc e l l m o d e l sf o r s c r e

27、 e n i n gi n h i b i t o r sa n d a c t i v a t o r so f w a t e r a q u a p o r i n sa n dC 1 一c h a n n e l s I nt h i ss t u d y , t h ef l u o r e s c e n tp r o t e i nE Y F P - V 1 6 3 Sh a sb e e nt a r g e t e dt oR O S A 2 6 l o c u sa tt h eg e n o m eo fE 1 4E Sc e l la n de s t a b l i

28、s h e ds e v e r a lE Sl i n e s ，t h et a r g e t i n gv e c t o r b a s e do n p o s i t i v ea n dn e g a t i v es e l e c t i o nw a su s e dw h i c hl e dt h ep o s i t i v er a t et o6 0 T w o c h i m e r a sw e r eo b t a i n e db u tt h et r a n s g e n i ct r a n s f e rf a i l e d ，t h er

29、e s u l to fP C R s c r e e n i n g s h o w e dt h a tE Y F P - V 1 6 3 Sd i s t r i b u t e di nb r a i n , s k e l e t o nm u s c l e ，h e a r t ，k i d n e y , p u l m o n a r y v e s s e l sb u tn o ti nt e s t i s T h e e x p r e s s i o n o ft h e t r a n s g e n e d e t e c t e d b y i m m u n

30、 o h i s t o c h e m i s t r y a n dw e s t e r n - b l o tW a si nt h ef i v e o r g a n sa b o v e T h e s er e s u l t s t e s t i f i e dt h a tt h ef a i l u r eo f t r a n s g e n i ct r a n s f e rw a s a t t r i b u t e dt on o ti n t e g r a t i n gf o rE Sc e l l s t og e r ml i n eo ft h

31、ec h i m e r a s T h ee f f o r tu s i n gd i f f e r e n tc l o n e so fe s t a b l i s h e dE Sc e l ll i n e s t om a k ec h i m e r a sh a sb e e nc a r r y i n go u t K e y w o r d s ：w a t e rc h a n n e la q u a p o r i n - 1 ；g e n et a r g e t i n g ；a n g i o g e n e s i s ；t u m o rg r o

32、w t h ；t h e m u t a n t so fE Y F Ps e n s i t i v et oH a l i d e ；t r a n s g e n i cm o u s e ；c h l o r i d ec h a n n e l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作

33、者签名：2 丕丝堡 日期： 瓣L 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、L 编学 位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名碰 日 期：凇石 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名： 电话： 邮编： 第一章A Q P l 在肿瘤血管生成中的作用研究 第一部分引言 水通道蛋白( A q

34、u a p o d n ，A Q P ) 是广泛存在于原核和真核细胞膜上转运水的特异孔 道。自从九十年代红细胞膜上的水通道蛋白l ( A Q P l ) 被发现以来，有关水通道蛋白 结构与功能的研究取得了迅速的、系列性的进展。到目前为止已克隆的哺乳动物水通 道蛋白家族有1 3 个成员，其基因结构、基因表达调控、染色体定位、蛋白结构、组织 分布等方面得到了较为深入、全面的研究。对其生理功能的研究也取得了很大进展， 尤其是各水通道蛋白基因敲除小鼠模型的建立后，水通道蛋白生理功能的研究进入到 崭新阶段。目前已证明水通道蛋白在体内液体转运生理中起重要作用。水通道蛋白在 机体内功能研究对于认识各器官、组

35、织液体转运生理、病理和指导疾病的临床治疗具 有重要意义。 一、水通道蛋白的发现、命名及分类 第一个水通道蛋白于1 9 8 8 年由A g r e 等从红细胞膜分离、纯化R h 血型多肽时偶 然发现1 1 J ，是一个2 8 k D a 的疏水性膜内在蛋白，称为形成通道的2 8 k D a 膜整合蛋白 ( C h a n n e l - F o r m i n gI n t e g r a lM e m b r a n eP r o t e i n2 8 k D a ，简称C H I P 2 8 ) 。1 9 9 1 年完成了 C H I P 2 8 的e D N A 克隆，1 9 9 2 年在

36、非洲爪蟾卵母细胞表达系统中证实了其水通道功能【2 】。 从而确认了细胞膜上存在有水转运通道蛋白的理论，A g r e 因此获得了2 0 0 3 年的诺贝尔 化学奖。C H I P 2 8 后经人类基因委员会命名为A q u a p o r i n 1 ( A Q P l ) 。 自从红细胞膜水遽道蛋白A Q P l 被发现并克隆以来，有关水通道蛋白结构与功能 的研究取得了迅速的、系列性的进展 3 - 5 1 。到目前为止经分子克隆发现的哺乳动物A Q P 家族已有1 3 个成员( A Q P 0 - - A Q P l 2 ) ，它们在蛋白质序列上有同源性。A Q P 蛋白分子 的一级结构是3

37、 0 k D a 左右的单肽链，由两个同向重复部分组成，前后两部分在氨基酸 序列上有同源性，包括两个高度保守的天冬氨酸脯氨酸一丙氨酸( N P A ) 序列，提示进 化过程中发生过基因的原位重复【6 】。A Q P 分子在细胞膜上形成含有6 个跨膜域的疏水 性膜内在蛋白口。10 1 。水通道蛋白家族中A Q P l 因容易从红细胞上大量纯化，其结构研究 的比较清楚。早期应用冷冻蚀刻电子显微镜技术证明A Q P l 在质膜上以四聚体形式存 在，这四个亚基作为水通道的作用都是独立的，但四聚体的结构对于维持单个亚基的 位置很重要【1 ”。A Q P l 晶体的三维结构为沙漏模式，分子中的两个同向重复

38、序列分别于 细胞膜内外两侧并于N P A 处折叠形成只容许单一水分子通过的孔道。孔道内部带正电 荷的氨基酸残基排斥带正电荷的质子通过1 1 “。目前根据这些A Q P 蛋白转运功能特性的 差异，将其分为两个亚家族：A Q P l 、2 、4 、5 、6 和A Q P 0 的基因结构类似，相互之间 氨基酸序列具有3 0 5 0 的同源性，并且对水分子的通透性具有高度选择性，成为 A Q P 家族中的水选择性通道( a q u a p o r i n ) 亚家族。A Q P 3 、7 、9 和A Q P l O 之间基因结 构和蛋白质序列相近似，除对水分子通透外，对甘油和尿素等中性小分子也具有通透

39、 性，成为A Q P 家族中的第二个亚家族，称作水- 甘油通道( a q u a g l y c e r o p o r i n ) 。A Q P 8 的基因结构与上述两个亚家族都不同，而且对水、甘油和尿素都有通透性，有可能成 为第三个亚家族。A Q P l 2 主要表达在细胞内膜系统中，参与细胞内消化酶类的分泌 1 。 一般认为，A Q P s 是处于持续开放状态的膜通道蛋白，水分子的转运不需消耗能量， 也不受门控机制影响。水分子通过水通道的移动方向完全由膜两侧的渗透压差决定， 水分子从渗透压低的一侧向渗透压高的一侧移动，直到膜两侧渗透压达到平衡。水通 道蛋白家族中除A Q P 4 外，其他

40、成员的转运功能都受汞化合物的抑制【1 4 1 。 二、水通道蛋白的组织分布、表达及调控 水通道在体内各系统组织中的表达很广【l ”8 】( 图1 ) ，除了在与体液分泌和吸收密 切相关的多种上皮和内皮细胞高表达外，在一些与体液转运无明显关系的组织细胞，如 红细胞、白细胞、脂肪细胞和骨骼肌细胞等处也有表达。图l 中综述了目前比较确定的 哺乳类动物水通道蛋白家族的组织分布。 水通道在体内受神经、细胞因子和激素等多种因素的调节。目前关于抗利尿激素对 肾脏集合管上皮水通道A O P 2 的调节研究较 3 9 4 0 ，包括蛋白质分选水平的急性调节和 转录水平的慢性调节。抗利尿激素作用于内髓集合管上皮主

41、细胞基底膜上的I I 型血管加 压素受体( V 2 R ) ，激活腺苷环化酶，使细胞内c A M P 水平增加。c A M P 一方面通过蛋白 激酶A 途径使A Q P 2 磷酸化，由此触发一系列机制使胞浆中含A Q P 2 的胞内体( e n d o s o m e ) 膜泡与顶质膜融合，将A Q P 2 水通道转移到顶质膜，从而使主细胞水通透性迅速提高， 集合管水的重吸收增加，此为急性调节1 4 l 】；另一方面，如果抗利尿激素的作用持续存在， 则主细胞内持续增加的c A M P 将进入细胞核，作用于A Q P 2 基因启动子中的c A M P 反式作 用因子( C R E ) ，促进A

42、Q P 2 基因的转录进而使A Q P 2 蛋白表达增加，形成A Q P 2 的慢性 调节。在其他水通道的调节方面，有证据表明糖皮质激素可显著增加肺毛细血管内皮 A Q P l 的表达并诱导培养的支气管上皮细胞表达A Q P 3 ；促胰液素( s e c r e t i n ) 可使胆管上 皮细胞内的A Q P l 转移到顶质膜上【4 2 】；肝细胞中的A Q P 8 主要分布于细胞内，在c A M P 作 用下可通过微管依赖性机制插入细胞质膜 4 3 1 ；A Q P 9 在附睾曲细精管上皮的表达有赖于 雄激素的存在m 1 ；角化细胞生长因子( K G F ) 1 4 5 1 和肿瘤坏死因子

43、( T N F c t ) 可降低肺泡上 皮细胞A Q P 5 的表达H q ；乙酰胆碱作用于腮腺上皮细胞的M 3 受体，通过增加细胞内钙离 子浓度促进含A Q P 5 的肺泡向顶膜转移和融合。 2 毛卦n 血管内皮 腺泡上皮 毛细皿管内皮 腺泡上皮 毛细m 管内皮 支气管上皮 粘膜下腺腺泡上皮 毛细血管内皮 肺泡上皮I 型细胞 肝内胆管上皮 月H 管上皮 肝细胞 颈部上皮 毛细衄管内皮 近曲小管上皮 亨利氏袢降支上皮 直小血管内皮 集合管上皮 隐窝上皮 远端结肠上皮 绒毛上皮 膀胱上皮 精于 曲细精管上皮 问质细胞和附睾 F i g u r e1 T i s s u ed i s t r i

44、 b u t i o no f a q u a p o r i nw a t e rc h a n n e l s 三、水通道蛋白的分子结构 脉络从 脑膜上皮 星形胶质细胞 室管膜细胞 中耳毛细血管内皮 螺旋管纤维细胞 内耳淋巴囊上皮 螺旋管支持细胞 纤毛细胞 红细胞 白细胞 毛细血管内皮 粘膜上皮 壁细胞和土细胞 红髓细胞 毛细血管内皮 外分泌腺泡 腺泡细胞 中心乳糜管内皮 【旦| 肠绒毛上皮 卒肠绒毛上皮 后角神经元 星形胶质细胞 毛细血管内皮 快肌纤维 表皮角化细胞 F 腺卜皮 ( 一) 水通道蛋白的初级结构 A Q P s 属主要内在蛋白( m a j o r i n t r i n

45、s i c p r o t e i n ，M I P ) 家族成员，序列分析显示M I P 基因内部由两个同向重复单元( T a n d o mr e p e a t s ) 组成，表明M I P 可能由基因串联重复 进化而来【6 】。人A Q P l 基因定位于染色体7 p 1 4 上，该蛋白的基因包含4 个外显子，编码 氨基酸第1 1 2 8 ，1 2 9 1 8 3 ，1 8 4 2 1 0 和2 1 1 2 6 9 位氨基酸序列，其间三个内含子的 长度为9 6 ，O 4 3 和0 8 0 k b 。A Q P l 基因的转录产物约为3 1k b ，5 端为5 8 b p 的非编码区，

46、随后是编码2 8 5 k D a 蛋白质的8 0 7 b p 开放阅读框架及约2 k b 的3 非翻译序列，最后为 p o l y A 尾。 A Q P 分子的基本结构是一个单肽链，包括两个同向重复单元，每个单元含有一 3 2坷【嚣 色皮 维非内皮 皮 纤体阿内膜体上 体状梁膜膜网状膜膜晶睫小虹角视睫结角 个保守存在的A s n P r o A l a ( N P A ) 氨基酸组单元( 见图2 a ) ，整个分子含有6 个跨膜 域( A 、B 、C 、D 、E 、F ) ，氨基酸链在膜两侧形成五个环形结构( 1 、2 、3 、4 、5 ) ( 见图2 b ) 。 ( a ) 图2 A Q P

47、 l 的一级结构( a ) 及跨膜结构模式图( b ) 2 和5 环显著疏水，l 环有N 一连接糖基化部位。拓扑学研究表明，2 、4 环及羧基、 氨基末端均在胞内，1 、3 和5 环定位于质膜外侧。整个分子由两个重复部分组成，前后 两部分在氨基酸序列上有同源性，在膜上彼此呈1 8 0 0 中心对称排列。A Q P l 的这种结构 或许可以解释水通道在水的吸收与分泌两个运动方向上所起的作用。2 、5 环含有 A s n P r o A l a ( N P A ) 重复串连序列( 第7 6 7 9 ，1 9 2 1 9 5 位) ，这是该蛋白家族成员所共 同具有的、高度同源的特征序列一2 、5 环

48、的任何变异都会引起水通道活性的下降。 位于红细胞和肾近曲小管的水通道蛋白A Q P t 功能可被H g C l 2 抑制【1 4 1 ，这也解释了 早期应用H g C l 2 作为利尿剂的机理。位于第1 8 9 位氨基酸残基是半胱氨酸，可与汞结合， 是汞制剂的作用位点。在此位置插入较半胱氨酸大的氨基酸可明显降低渗透压差引起的 水的通透性，提示1 8 9 位的半胱氨酸可能位于水通道的开口附近。2 环上第7 3 位点与 1 8 9 位点一样，只是2 环位于细胞外。在1 8 9 位上半胱氨酸被替换后水通道对汞制剂不 4 再敏感，在7 3 位上引入半胱氨酸后又恢复对汞制剂的敏感，在此位置上替换成大残基

49、 的氨基酸后又降低了水的通透性。这些提示7 3 与1 8 9 号位点位于水通道的开口附近。 某些水通道蛋白如A Q P 4 在该位置无半胱氨酸，故对汞不敏感。 A Q P l 肽链上第4 2 位氨基酸是丝氨酸，具有N 一连接糖基化作用。糖基化的A Q P l 蛋白分子量大致介于4 0 6 0 k D a 之间，单糖分析及糖苷酶消化表明其寡糖成分是N 一乙 酰氨基葡萄糖、甘露糖、半乳糖及果糖。定量分析表明每4 个A Q P l 单体中有两个是糖 基化的【4 ”，但这种糖基化作用对A Q P l 表达、分子结构稳定及功能的实现似乎并不重要 1 4 7 - 4 9 1 。 ( 二) 水通道蛋白的高级结构 A Q P l 二级结构是由4 0 的n 一螺旋、D 一片层和D 一转角构成。它含有6 个跨膜的 疏水一螺旋及包含N P A 环区的反向平行的B 一片层，这些片层伸入磷脂双层，并在质 膜上形成孔道。 因为A Q P l 易于大量从人类红细胞膜上进行纯化，故对水通道蛋白结构的认识大多 源于A Q P l 的研究。早期应用冰冻蚀刻电子显微镜技术，其研究提示A Q P l 在质膜上以 四聚体形式存在。A Q P l 蛋白结晶成功后，电子晶体衍射图分析发现每个单体是一个独 立的功能单位【) 。 A Q P l 的四级结构是由4 个对称排列的各长5 r i